hifiasm 是一种快速的单倍型解析从头组装工具，最初专为 PacBio HiFi 测序数据设计。其最新版本支持利用超长 Oxford Nanopore 测序数据进行端粒到端粒（telomere-to-telomere, T2T）组装。Hifiasm 结合 HiFi、超长测序数据和 Hi-C 数据，能够生成目前最优质的单样本端粒到端粒组装结果。此外，在提供父本和母本的 NGS 数据的情况下，它也是分型组装（trio-binning）中最优秀的单倍型解析组装工具之一。对于人类基因组，Hifiasm 可在一天内完成端粒到端粒组装。

目前 hifiasm 的 latest 版本号为 0.24.0-r702, 从 0.20.0-r639 版本以来，hifiasm 做了不少有关纠错部分及 ONT 组装部分的大更新，同时作者表示，高深度 (>60 X) 数据产生次优组装结果是已知问题，并提供了临时解决方案。由于我之前使用的版本是 0.19.9-r616, 对于这几个版本的更新效果非常好奇，于是准备了高深度数据对比组装结果，尤其以 0.19.9, 0.24.0 两个版本的比较为主。

本次测试使用数据为 SRR26555721, 来自西瓜泛基因组的文章；HiFi base 约为 54.1G, 文章中组装大小为 364.5 M, 数据深度约 148 X.

组装结果

组装结果统计

首先对组装结果做个基本统计：

这里用相同的数据跑了三个版本的 hifiasm, 全部使用默认参数，不指定 -l 或 -n 等。可以看到 0.18.9 版本和 0.19.9 版本组装结果基本一致，N 50 水平一致，总 contig 数量也差不多。而 0.24.0 版本的结果相比之下反而差一些，contig 数量较多，N50 反而会低一点。

然后看一下 N50-N90 水平，0.24.0 版本的结果也没什么优势。

三代数据回比

为了进一步比较组装质量，我将三代数据回比到了组装结果上，minimap2 比对参数为 -x map-hifi -x asm20 --MD -a 没什么特殊的，随后使用 samtools 获得 .sort.bam , 并使用 pandepth 统计覆盖度深度，有意思的来了：

98.8%本身很不错了，就怕别人都是 99+; 这个原因我们暂且按下不表，先看看别的评估结果；

端粒信号鉴定

使用 quarTeT 鉴定端粒特征信号，特征序列使用 AAACCCT, 统计结果如下：

西瓜本身 11 条染色体，总计 22 个端粒，不同版本总计获得 20 个左右端粒信号，整体比较合理。

问题排查

首先我好奇为啥 0.24.0 组装版本三代数据回比结果会低一些？查看了具体比对结果后，发现部分回比结果异常，这里主要比较 0.19.9 版本的结果，与 0.24.0 版本的结果。以 ptg000001l 为例：

这里上图是 0.24.0 版本的结果，下图是 0.19.9 版本的结果

可以看到，0.24.0 版本的组装结果存在一些无 reads 覆盖的区域，对于我这个例子甚至集中在端粒区。对于本身组装结果，两个版本的组装大小如下：

而上面我使用 quarTeT 鉴定了端粒重复序列，对于两个 ptg000001l, 起始端重复单元重复次数如下：

可以看到，0.24.0 版本的结果相比 0.19.9 版本的结果大了 300 kb 左右，但是差异又不全部来自端粒序列，这里我对两条 contig 用 mumer4 做了比对，结果如下：

对于这个问题我在 hifiasm 的 GitHub 主页上提了 issue, 作者建议我看一下 gfa 中的结果，这里可以看到，对 0.24.0 版本的结果，用于组装的 reads 没有比对回对应的位置：

比对 paf 文件中，显示这个 reads 比对到了其他地方：

目前这个问题没有其他进展，很难讲会不会是比对的问题；我自己的话大概会继续使用 0.19.9 版本，等待这个问题有进一步答复。issue 的链接放在这里，有进展我也会及时同步。